Чтобы понять, что же такое флуоресцентная микроскопия и принцип проведения исследований с ее помощью, нужно разобраться, как работают люминесцентные микроскопы.

Люминесцентные микроскопы работают, используя возможности естественного свечения клеток биологических организмов. Такие микроскопы способны заставить светится исследуемый объект посредством совместной работы двух светофильтров: возбуждающего и запирающего.

Возбуждающий светофильтр провоцирует свечение исследуемого объекта, а запирающий, в свою очередь, блокирует возбуждающий, оставляя только естественное или же люминесцентное свечение определенной исследуемой клетки.

Итак, можем сделать вывод, что флуоресцентная микроскопия — это исследование структуры клеток, на основе использования их естественного (природного) свечения.

Первый люминесцентный микроскоп был создан в 1911 году . Возможность его использования была доказана ученым А. Келлером. Известно также, что впервые использовал данное изобретение для проведения научных исследований русский ученый М. Цвет, который показал миру флуоресцентные возможности свечения хлорофилла в клетках растений.

В наше время люминесцентные микроскопы активно используются в таких научных сферах, как:

• микробиология;
• вирусология;
• гематология;
• цитодиагностика;
• цитогенетика.

В медицине флуоресцентная микроскопия используется для исследований разного рода грибковых заболеваний, к которым относится кандидоз, вызванный грибами CandidaAlbicans.

Как уже говорилось выше, флуоресцентная микроскопия активно используется в медицине, в частности, в гинекологии . Люминесцентные микроскопы способны с высокой точностью выявить вредоносные колонии грибков, которые доставляют пациенткам немало дискомфорта.

Люминесценцию также используют, чтобы обнаружить:

• кислотоустойчивые микобактерии;
• возбудителей и .

Исследовать такие образцы, как, к примеру, витамины А и В2, а также хлорофилл стоит как можно быстрее, поскольку от влияния на них УФ-излучением, они могут потерять свои люминесцентные способности.

Пожалуй, единственным минусом флуоресцентной микроскопии является покупка самого оборудования для исследований, а также высокая стоимость расходных материалов . Кроме того, чтобы проводить исследования на люминесцентном оборудовании необходимо дополнительное обучение сотрудников лаборатории.

Лампы на флуоресцентном микроскопе очень чувствительны, быстро изнашиваются, их следует регулярно осматривать на предмет поломок и заменять. Малейшее колебание напряжения электричества может вывести такой микроскоп из строя.

Возбуждённых атомов и молекул образца. Широко применяется в материаловедении и медико-биологических областях.

Энциклопедичный YouTube

1 / 3

✪ Флюоресцентная микроскопия: от клетки до молекулы

✪ Флуоресцентная микроскопия (опухоль головного мозга)

✪ Patrushev about super resolved fluorescence microscopy

Субтитры

Описание

Биологический материал, как правило, сам по себе флуоресцирует крайне слабо, но благодаря применению ярких и разнообразных флуоресцентных молекул (флуорофоров), способных специфически окрашивать разные структуры тканей и клеток, метод флуоресцентной микроскопии оказался очень ценным для медико-биологических наук.

Традиционные методы флуоресцентной микроскопии обладают существенно более низким разрешением по сравнению с электронной или атомно-силовой микроскопией . Однако в отличие от последних, оптическая микроскопия позволяет наблюдать за внутренней микроструктурой клеток и даже небольших организмов, причем не только фиксированных, но и живых. Благодаря этому флуоресцентная микроскопия оказалась наилучшим методом для изучения механизмов функционирования организмов на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях.

Во флуоресцентном микроскопе образец облучается светом с большей частотой , а изображение получают в оптическом спектре. Излучение образца, соответственно, пропускается через фильтр, отсекающий свет на частоте возбуждения. Изображение флюоресцентного препарата может быть сфотографировано специализированной цифровой камерой, позволяющей делать снимки с большой выдержкой. Для некоторых изображений это время может достигать 60 минут.

Интенсивное развитие флуоресцентной микроскопии на рубеже XX-го и XXI-го веков привело к развитию новых методов - двухфотонной и конфокальной микроскопии, а также ряда подходов, позволивших преодолеть дифракционный барьер оптического разрешения и достичь беспрецедентного нано-разрешения.

Одним из видов флуоресцентной микроскопии является конфокальная микроскопия - метод, позволяющий получать изображения с некоторой глубины в середине образца. Простейший метод, с помощью которого можно исследовать поверхность, называют эпифлуоресцентной микроскопией.

Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения

Метод флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRFM) основан на явлении отражения электромагнитных волн от границы раздела двух прозрачных сред, которое возникает при условии, что волна падает из среды с более высоким показателем преломления под углом, превышающем критический (1/n). Интенсивность излучения, проникающего во вторую среду затухает по экспоненциальному закону, что позволяет детектировать флуоресцентные объекты, возбуждаемые этим излучением, в пограничном слое толщиной ~100 нм с разрешением до 10 нм . Таким образом, TIRFM может по праву считаться одним из методов флуоресцентной наноскопии. В биологии метод используется для визуализации плазматической мембраны и примембранных структур клеток.

Флуоресцентная наноскопия

В последние годы было разработано несколько новых подходов в области флуоресцентной микроскопии, которые позволили преодолеть дифракционный барьер оптического разрешения и достичь беспрецедентного разрешения ~10 нм. Эти методы стали объединять общим термином флуоресцентная наноскопия.

Системы флуоресцентной наноскопии построены на трёх принципиально различающихся подходах:

• улучшение фокусировки за счёт создания новых оптических схем и применения объективов с высокой угловой апертурой (4Pi, I5M и I5S микроскопия);
• использование явления полного внутреннего отражения (total internal reflection fluorescence microscopy, TIRFM);
• контролируемое «включение» и «выключение» флуоресцентных молекул и последовательное их детектирование (STED, GSD, SPEM (SSIM), RESOLFT, (F)PALM, STORM, PAINT).

Можно предвидеть несколько приложений флуоресцентных наноскопических методов в биологии и медицине. Наноскопия позволяет напрямую изучать взаимодействия между

Поглощение и дальнейшее переизлучение света неорганическими и органическими средами является результатом фосфоресценции или флуоресценции. Разница между феноменами состоит в продолжительности интервала между световым поглощением и испусканием потока. При флуоресценции эти процессы происходят практически одновременно, а при фосфоресценции - с некоторым опозданием.

Историческая справка

В 1852 г. британский ученый Стокс впервые описал флуоресценцию. Он ввел новый термин в результате выполненных экспериментов с который испускал красный свет под воздействием ультрафиолета. Стокс отметил интересное явление. Он выявил, что длина волны при флуоресцентном излучении всегда больше, чем у потока света возбуждения.

Для подтверждения гипотезы в 19-м столетии было проведено множество экспериментов. Они показали, что разнообразные образцы флуоресцируют под действием ультрафиолета. Среди материалов, в числе прочего, были кристаллы, смолы, минералы, хлорофилл, лекарственное сырье, неорганические соединения, витамины, масла. Непосредственное же применение красителей для проведения биологических анализов началось только в 1930 г.

Флуоресцентная микроскопия: описание

Некоторые из материалов, использованных в исследованиях первой половины 20-го столетия, обладали высокой специфичностью. Благодаря показателям, которые не могли быть достигнуты контрастными способами, стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Немаловажное значение полученные результаты имели и для материаловедения.

Какие преимущества имеет метод флуоресцентной микроскопии ? С помощью новых материалов стало возможным выделение высокоспецифичных клеток и субмикроскопических компонентов. Флуоресцентный микроскоп позволяет обнаружить отдельные молекулы. Разнообразные красители позволяют идентифицировать несколько элементов одновременно. Несмотря на ограниченность пространственного разрешения оборудования дифракционным пределом, который, в свою очередь, зависит от специфических свойств образца, выявление молекул ниже этого уровня также вполне возможно. Различные образцы после облучения проявляют автофлуоресценцию. Это явление достаточно широко применяется в петрологии, ботанике, полупроводниковой промышленности.

Особенности

Изучение животных тканей либо патогенных микроорганизмов зачастую осложняется или слишком слабой, или очень сильной неспецифичной автофлуоресценцией. Однако значение в исследованиях приобретает внесение в материал компонентов, возбуждаемых на конкретной длине волны и испускающих световой поток необходимой интенсивности. Флуорохромы выступают в качестве красителей, способных самостоятельно прикрепляться к структурам (невидимым или видимым). При этом они отличаются высокой избирательностью относительно мишеней и квантовым выходом.

Флуоресцентная микроскопия стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Они обладали определенными профилями интенсивности испускания и возбуждения и были нацелены на конкретные биологические мишени.

Выявление отдельных молекул

Часто в идеальных условиях можно зарегистрировать свечение отдельного элемента. Для этого, кроме прочего, нужно обеспечить достаточно низкий шум детектора и оптический фон. Молекула флуоресцеина до разрушения вследствие фотообесцвечивания может испускать до 300 тыс. фотонов. При 20 % собираемости и эффективности процесса их можно зарегистрировать в количестве порядка 60 тыс.

Флуоресцентная микроскопия , основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут.

Сложности

Ключевой проблемой выступает подавление шума от оптического фона. В связи с тем, что многие из материалов, используемых в конструкции фильтров и линз, проявляют некоторую автофлуоресценцию, усилия ученых на начальных этапах были ориентированы на выпуск компонентов, обладающих малой флуоресценцией. Однако последующие эксперименты привели к новым выводам. В частности, было установлено, что , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока.

Механизм

Принципы флуоресцентной микроскопии , основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Она возникает на границе сред с различными В данном случае световой пучок проходит сквозь призму. Она обладает высоким параметром преломления.

Призма прилегает к водному раствору или стеклу с низким параметром. Если поток света направляется на нее под углом, который больше критического, пучок полностью отражается от границы раздела. Это явление, в свою очередь, вызывает нераспространяющуюся волну. Другими словами, генерируется электромагнитное поле, проникающее в среду с меньшим параметром преломления на расстояние меньше 200 нанометров.

В нераспространяющейся волне будет вполне достаточной для возбуждения флуорофоров. Однако вследствие ее исключительно незначительной глубины его объем будет очень малым. В результате возникает низкоуровневый фон.

Модификация

Флуоресцентная микроскопия, основанная на полном внутреннем отражении, может реализовываться с помощью эпи-освещения. Для этого необходимы объективы с повышенной числовой апертурой (как минимум 1.4, однако желательно, чтобы она достигала 1.45-1.6), а также частично освещенное поле аппарата. Последнее достигается с помощью пятна небольшого размера. Для большей равномерности используется тонкое кольцо, посредством которого блокируется часть потока. Для получения критического угла, после которого возникает полное отражение, нужен высокий уровень преломления иммерсионной среды в линзах и покровного стекла микроскопа.

Гибкость метода
Минимальный	Очень маленький	Очень маленький		Небольшой
размер образца
Максимальный	Небольшой	Небольшой	Нет ограничений
размер образца
Стоимость		Умеренная	Умеренная
Тип препарата	Нерастворенный или не способный		Растворенный или	Только частички
	раствориться		способный
			раствориться

1) Обозначение звездочками - чем больше звездочек, тем большее преимущество имеет метод.

8. Благодарности

Данная глава была написана, когда автор работал в качестве приглашенного профессора в отделе молекулярной и клеточной биологии в Университете Коннектикута, Коннектикут, США. Я хотел бы поблагодарить сотрудников отдела, в частности д-ра Эмори Брэсуелла (Emory Braswell), за их гостеприимство, а также сотрудников университетской библиотеки имени Уилбара Кросса за их помощь. Я благодарен также Университету Шеффилда за разрешение на финансирование моих исследований.

9. Указанные в тексте работы и литература для дальнейшего чтения

Теоретические основы

1. Baker, I. R. (1958) Principles of Biological Microtechnique: A Study of Fixation and Dyeing, Methuen, London.

2. Horobin, R. W. (1988) Understanding Histochemistry: Selection, Evaluation and Design of Biological Stains. Ellis Horwood, Ghichester.

Источники технической информации (табл. 5.20)

3. Bancroft, J. D. and Stevens, A. (1989) Theory and Practice of Histological Techniques, Churchill Livingstone, Edinburgh, 3nd edn.

4. Lillie, R. D. and Fullmer, H. M. (1976) Histopathologic Technic and Practical Histochemistry, McGraw-Hill, New York, 4-е изд.

5. Thompson, S. W. and Luna, L. (1978) An Atlas of Artifacts Encountered in the Preparation of Microscopic Tissue Sections. Thomas Springfield, IL.

6 Pearse, A. G. E. (1968, 1972, 1988) Histochemistry, Theoretical and Applied. Vol. 1, Chirchill, London, Vol. 2, Chirchill, Livingstone, Edinburh, and Vol 3 (Имеется перевод: Пирс А. Г. Гистохимия, М. Мир, 1962).

7. Clark, G. (1981) Staining Procedures. Williams and Wilkins, Baltimore, MD, 4th edn.

8. Gahan, P. B. (1984) Plant Histochemistry and Cytochemistry: an Introduction. Academic Press, New York.

9. Jensen, W. A. (1962) Botanical Histochemistry, Principles and Practice. Freeman, San Francisco, CA.

10. Thompson, S. W. (1966) Selected Histochemical and Histopathological Methods. Thomas, Springfield, IL.

11. Adams, C. W. M. (1965) Neurohistochemistry. Elsevier, Amsterdam.

Литература по очистке реагентов и их номенклатуре

12. Horobin, R. W. (1969) Histochem. J., 1, 115.

13. Lillie, R. D. (1977) Conn"s Biological Stains. Williams and Wilkms, Baltimore, MD, 9th edn.

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ

Иохан С. Плоэм

1. Введение

В основе флуоресцентной микроскопии лежит способность некоторых веществ поглощать свет определенной части спектра, энергия которого затем частично выделяется в виде света. Испускаемый свет отличается от поглощенного света длиной волны и интенсивностью. В соответствии с правилом Стокса длина волны испускаемого света больше, чем длина волны поглощаемого света, и эта разность длин волн лежит в основе наблюдения флуоресценции при флуоресцентной микроскопии. Интенсивность испускаемого света меньше, чем интенсивность возбуждающего света, так как количество выделяемой энергии во много раз

Флуоресцентная микроскопия (англ. fluorescence microscopy ) - метод получения увеличенного изображения с использованием люминесценции возбуждённых атомов и молекул образца. Широко применяется в материаловедении и медико-биологических областях.

Описание

Биологический материал, как правило, сам по себе флуоресцирует крайне слабо, но благодаря применению ярких и разнообразных флуоресцентных молекул (флуорофоров), способных специфически окрашивать разные структуры тканей и клеток, метод флуоресцентной микроскопии оказался очень ценным для медико-биологических наук.

Традиционные методы флуоресцентной микроскопии обладают существенно более низким разрешением по сравнению с электронной или атомно-силовой микроскопией . Однако в отличие от последних, оптическая микроскопия позволяет наблюдать за внутренней микроструктурой клеток и даже небольших организмов, причем не только фиксированных, но и живых. Благодаря этому флуоресцентная микроскопия оказалась наилучшим методом для изучения механизмов функционирования организмов на клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях.

Во флуоресцентном микроскопе образец облучается светом с большей частотой , а изображение получают в оптическом спектре. Излучение образца, соответственно, пропускается через фильтр, отсекающий свет на частоте возбуждения. Изображение флюоресцентного препарата может быть сфотографировано специализированной цифровой камерой, позволяющей делать снимки с большой выдержкой. Для некоторых изображений это время может достигать 60 минут.

Интенсивное развитие флуоресцентной микроскопии на рубеже XX-го и XXI-го веков привело к развитию новых методов - двухфотонной и конфокальной микроскопии, а также ряда подходов, позволивших преодолеть дифракционный барьер оптического разрешения и достичь беспрецедентного нано-разрешения.

Одним из видов флуоресцентной микроскопии является конфокальная микроскопия - метод, позволяющий получать изображения с некоторой глубины в середине образца. Простейший метод, с помощью которого можно исследовать поверхность, называют эпифлуоресцентной микроскопией.

Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения

Метод флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRFM) основан на явлении отражения электромагнитных волн от границы раздела двух прозрачных сред, которое возникает при условии, что волна падает из среды с более высоким показателем преломления под углом, превышающем критический (1/n). Интенсивность излучения, проникающего во вторую среду затухает по экспоненциальному закону, что позволяет детектировать флуоресцентные объекты, возбуждаемые этим излучением, в пограничном слое толщиной ~100 нм с разрешением до 10 нм . Таким образом, TIRFM может по праву считаться одним из методов флуоресцентной наноскопии. В биологии метод используется для визуализации плазматической мембраны и примембранных структур клеток.

Флуоресцентная наноскопия

В последние годы было разработано несколько новых подходов в области флуоресцентной микроскопии, которые позволили преодолеть дифракционный барьер оптического разрешения и достичь беспрецедентного разрешения ~10 нм. Эти методы стали объединять общим термином флуоресцентная наноскопия.

Системы флуоресцентной наноскопии построены на трёх принципиально различающихся подходах:

• улучшение фокусировки за счёт создания новых оптических схем и применения объективов с высокой угловой апертурой (4Pi, I5M и I5S микроскопия);
• использование явления полного внутреннего отражения (total internal reflection fluorescence microscopy, TIRFM);
• контролируемое «включение» и «выключение» флуоресцентных молекул и последовательное их детектирование (STED, GSD, SPEM (SSIM), RESOLFT, (F)PALM, STORM, PAINT).

Можно предвидеть несколько приложений флуоресцентных наноскопических методов в биологии и медицине. Наноскопия позволяет напрямую изучать взаимодействия между белками , ДНК и РНК , и, следовательно, может сыграть существенную роль в развитии геномики и протеомики , в изучении физиологии клетки, в понимании патофизиолоических механизмов, связанных с нарушением образования сложных белковых комплексов и т. п.

• 4Pi и I5M реализованы на основе двухобъективной системы, которая позволяет улучшить разрешение вдоль оптической оси до 80 нм благодаря суммированию в фокальной точке двух встречных сферических фронтов света. I5S обладает улучшенным разрешением и в фокусной плоскости (до 100 нм).
• TIRFM позволяет детектировать флуоресцентные объекты в пограничном слое толщиной ~100 нм с разрешением до 10 нм.
• STED, GSD, SPEM (SSIM), RESOLFT, (F)PALM, STORM, PAINT. Поглощение кванта света молекулой сопровождается переходом электрона с основного энергетического уровня (S 0) на возбужденный флуоресцентный уровень (синглетный S 1 или триплетный T 1). Поглощение также может индуцировать обратимые внутримолекулярные перестройки (например, цис-транс изомеризацию), в результате которых происходит изменение спектра флуоресценции . Любой из переходов S 0 →S 1 , S 0 →T 1 может быть использован для включения/выключения флуорофоров и увеличения разрешения.

См. также

Напишите отзыв о статье "Флуоресцентная микроскопия"

Примечания

Литература

• Kässens M. et al. Basics of Light Microscopy & Imaging. - GIT Verlag GmbH & Co. KG, 2006. - 52 p.
• Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der Mikroskopischen Wahrnehmung // Arch. Mikrosc. Anat. Entwicklungsmech. 1873. Bd. 9. S. 413–468.
• Truskey, G.A., Burmeister, J.S., Grapa, E. el al. Journal of Cell Science Volume 103, Issue 2, 1992, P. 491–499.
• Axelrod, D. Journal of Biomedical Optics Volume 6, Issue 1, January 2001, Pages 6–13.
• Hell S.W. Far-Field Optical Nanoscopy // Science. 2007. V. 316. P. 1153–1158.

Ссылки

При написании этой статьи использовался материал из издания «Словарь нанотехнологических терминов Creative Commons

При написании этой статьи использовался материал из издания «Словарь нанотехнологических терминов » (2009-…), доступного по лицензии Creative Commons .

При написании этой статьи использовался материал из издания «Словарь нанотехнологических терминов » (2009-…), доступного по лицензии Creative Commons .

• (англ.)

Отрывок, характеризующий Флуоресцентная микроскопия

– Хватит пустых разговоров! – вдруг, довольно потирая руки, воскликнул «святой отец». – Пройдёмте со мной, моя дорогая, я думаю, на этот раз мне всё же удастся Вас ошеломить!..
Если бы он только знал, как хорошо это ему постоянно удавалось!.. Моё сердце заныло, предчувствуя недоброе. Но выбора не было – приходилось идти...

Довольно улыбаясь, Караффа буквально «тащил» меня за руку по длинному коридору, пока мы наконец-то не остановились у тяжёлой, украшенной узорчатой позолотой, двери. Он повернул ручку и... О, боги!!!.. Я оказалась в своей любимой венецианской комнате, в нашем родном фамильном палаццо...
Потрясённо озираясь вокруг, не в состоянии придти в себя от так неожиданно обрушившегося «сюрприза», я успокаивала своё выскакивающее сердце, будучи не в состоянии вздохнуть!.. Всё вокруг кружилось тысячами воспоминаний, безжалостно окуная меня в давно прожитые, и уже частично забытые, чудесные годы, тогда ещё не загубленные злостью жестокого человека... воссоздавшего для чего-то здесь(!) сегодня мой родной, но давно утерянный, счастливый мир... В этой, чудом «воскресшей», комнате присутствовала каждая дорогая мне моя личная вещь, каждая любимая мною мелочь!.. Не в состоянии отвести глаз от всей этой милой и такой привычной для меня обстановки, я боялась пошевелиться, чтобы нечаянно не спугнуть дивное видение...
– Нравится ли вам мой сюрприз, мадонна? – довольный произведённым эффектом, спросил Караффа.
Самое невероятное было то, что этот странный человек совершенно искренне не понимал, какую глубокую душевную боль он причинил мне своим «сюрпризом»!.. Видя ЗДЕСЬ (!!!) то, что когда-то было настоящим «очагом» моего семейного счастья и покоя, мне хотелось лишь одного – кинуться на этого жуткого «святого» Папу и душить его в смертельном объятии, пока из него не улетит навсегда его ужасающая чёрная душа... Но вместо того, чтобы осуществить так сильно мною желаемое, я лишь попыталась собраться, чтобы Караффа не услышал, как дрожит мой голос, и как можно спокойнее произнесла:
– Простите, ваше святейшество, могу ли я на какое-то время остаться здесь одна?
– Ну, конечно же, Изидора! Это теперь ваши покои! Надеюсь, они вам нравятся.
Неужели же он и в правду не понимал, что творил?!.. Или наоборот – прекрасно знал?.. И это всего лишь «веселилось» его неугомонное зверство, которое всё ещё не находило покоя, выдумывая для меня какие-то новые пытки?!.. Вдруг меня полоснула жгучая мысль – а что же, в таком случае, стало со всем остальным?.. Что стало с нашим чудесным домом, который мы все так сильно любили? Что стало со слугами и челядью, со всеми людьми, которые там жили?!.
– Могу ли я спросить ваше святейшество, что стало с нашим родовым дворцом в Венеции?– севшим от волнения голосом прошептала я. – Что стало с теми, кто там жил?.. Вы ведь не выбросили людей на улицу, я надеюсь? У них ведь нет другого дома, святейшество!..
Караффа недовольно поморщился.
– Помилуйте, Изидора! О них ли вам стоит сейчас заботиться?.. Ваш дом, как вы, конечно же, понимаете, теперь стал собственностью нашей святейшей церкви. И всё, что с ним было связано – более уже не является Вашей заботой!
– Мой дом, как и всё то, что находится внутри него, Ваше святейшество, после смерти моего горячо любимого мужа, Джироламо, принадлежит моей дочери Анне, пока она жива! – возмущённо воскликнула я. – Или «святая» церковь уже не считает её жильцом на этом свете?!
Внутри у меня всё кипело, хотя я прекрасно понимала, что, злясь, я только усложняла своё и так уже безнадёжное, положение. Но бесцеремонность и наглость Караффы, я уверена, не могла бы оставить спокойным ни одного нормального человека! Даже тогда, когда речь шла всего лишь о поруганных, дорогих его сердцу воспоминаниях...
– Пока Анна будет жива, она будет находиться здесь, мадонна, и служить нашей любимой святейшей церкви! Ну, а если она, к своему несчастью, передумает – ей, так или иначе, уже не понадобится ваш чудесный дом! – в бешенстве прошипел Караффа. – Не переусердствуйте в своём рвении найти справедливость, Изидора! Оно может лишь навредить вам. Моё долготерпение тоже имеет границы... И я искренне не советую вам их переступать!..
Резко повернувшись, он исчез за дверью, даже не попрощавшись и не известив, как долго я могу оставаться одна в своём, так нежданно воскресшем, прошлом...
Время остановилось... безжалостно швырнув меня, с помощью больной фантазии Караффы, в мои счастливые, безоблачные дни, совсем не волнуясь о том, что от такой неожиданной «реальности» у меня просто могло остановиться сердце...
Я грустно опустилась на стул у знакомого зеркала, в котором так часто когда-то отражались любимые лица моих родных... И у которого теперь, окружённая дорогими призраками, я сидела совсем одна... Воспоминания душили силой своей красоты и глубоко казнили горькой печалью нашего ушедшего счастья...
Когда-то (теперь казалось – очень давно!) у этого же огромного зеркала я каждое утро причёсывала чудесные, шёлковистые волосы моей маленькой Анны, шутливо давая ей первые детские уроки «ведьминой» школы... В этом же зеркале отражались горящие любовью глаза Джироламо, ласково обнимавшего меня за плечи... Это зеркало отражало в себе тысячи бережно хранимых, дивных мгновений, всколыхнувших теперь до самой глубины мою израненную, измученную душу.
Здесь же рядом, на маленьком ночном столике, стояла чудесная малахитовая шкатулка, в которой покоились мои великолепные украшения, так щедро когда-то подаренные мне моим добрым мужем, и вызывавшие дикую зависть богатых и капризных венецианок в те далёкие, прошедшие дни... Только вот сегодня эта шкатулка пустовала... Чьи-то грязные, жадные руки успели «убрать» подальше все, хранившееся там «блестящие безделушки», оценив в них только лишь денежную стоимость каждой отдельной вещи... Для меня же это была моя память, это были дни моего чистого счастья: вечер моей свадьбы... рождение Анны... какие-то мои, уже давно забытые победы или события нашей совместной жизни, каждое из которых отмечалось новым произведением искусства, право на которое имела лишь я одна... Это были не просто «камни», которые стоили дорого, это была забота моего Джироламо, его желание вызвать мою улыбку, и его восхищение моей красотой, которой он так искренне и глубоко гордился, и так честно и горячо любил... И вот теперь этих чистых воспоминаний касались чьи-то похотливые, жадные пальцы, на которых, съёжившись, горько плакала наша поруганная любовь...