Принципы и методы санитарно-микробиологических исследований. Методы проведения санитарно-микробиологических исследований Методы санитарно микробиологических исследований

(предусматривают определение общей микробной обсеменённости (ОМЧ), определение и титрование санитарно-показательных микроорганизмов).

Санитарно-микробиологическое состояние воздуха закрытых помещений оценивают по общему микробному числу (ОМЧ) – количеству особей, обнаруживаемых в 1 м 3 воздуха, наличию санитарно-показательных бактерий: гемолитических стрептококков, золотистых стафилококков, а также дрожжевых и плесневых грибов.

Согласно СанПиН 2.1.3.1375-03, воздушная среда помещений лечебных учреждений и аптек по уровню бактериальной обсемененности разделена на 4 класса.

Микробиологические показатели для оценки воздушной среды аптечных учреждений можно определить путем посева воздуха седиментационным (по Коху) или аспирационным методом (в аппарате Кротова).

Допустимые уровни бактериальной обсеменённости воздушной среды помещений лечебных учреждений в зависимости от их
функционального назначения и класса чистоты

Класс чистоты	Название помещений	Санитарно-микробиологические показатели
общее количество микроорганизмов в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3)	количество колоний S.aureus в 1 м 3 воздуха (КОЕ/м 3)	количество плесневых и дрожжевых грибов в 1 дм 3 воздуха
До начала	Во время работы	До начала	Во время работы	До начала	Во время работы
Особо чистые(А)	Операционные, родильный зал, асептические боксы для гематологических, ожоговых больных, палата для недоношенных, асептический блок аптек, стерилизационные (чистая половина) боксы бактериологических лабораторий	не более200	не более500	не должно быть	не должно быть	не должно быть	не должно быть
Чистые(Б)	Процедурные, перевязочные, предоперационные, палаты реанимации, залы реанимации, детские палаты, комнаты сбора и пастеризации грудного молока, ассистентские и фасовочные аптек, дистилляторная,помещения бактериологических и клинических лабораторий, предназначенные для исследований	не более500	не более750	не должно быть	не должно быть	не должно быть	не должно быть
Условно чистые(В)	Палаты хирургических отделений; коридоры, примыкающие к операционным и родильным залам; смотровые, боксы и палаты инфекционных отделений, ординаторские, материальные, кладовые чистого белья	не более750	не более1000	не должно быть	не более2	не должно быть	не должно быть
Грязные (Г)	Коридоры и помещения административных зданий, лестницы, лечебно-диагностические, санитарные комнаты, туалеты, комнаты грязного белья	Не нормируются

Седиментационный метод (по Коху) – оседание микробов под действием силы тяжести - является простым способом изучения микрофлоры воздуха. Он заключается в том, что чашки Петри со средой оставляют открытыми на определённое время (5-10 минут на общую обсеменённость и не менее 40 минут на кокковую микрофлору), затем их закрывают, маркируют и выдерживают 24 часа в термостате и 24 часа при комнатной температуре. Количество выросших колоний соответствует степени загрязнённости воздуха: по приблизительному подсчёту на площадь 100 см 2 в течение 5 минут оседает столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха.

Аспирационный метод – более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью приборов. Аппарат Кротова устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью просасывается через узкую щель плексигласовой пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фиксируются на всей поверхности среды благодаря постоянному вращению чашки под входной щелью.

После инкубации посева в термостате проводят расчет микробного числа по формуле:

ОМЧ	=	N ∙ 1000
V

где N – количество выросших на чашке колоний;

V – объём пропущенного через прибор воздуха, дм 3 ;

1000 - искомый объём воздуха, дм 3 .

Наличие санитарно-показательных для воздуха микроорганизмов – золотистого стафилококка, гемолитического стрептококка, плесневых грибов, кандид – определяют по характеру выросших колоний на специальных средах (желточно-солевом агаре, кровяном агаре, среде Сабуро) и при микроскопическом изучении бактерий из этих колоний.

Контрольные вопросы.

Каковы особенности ферментных систем бактерий? Виды ферментов: по их действию; по выделению в окружающую среду; конститутивные и адаптивные ферменты. Какое практическое значение имеет изучение ферментативной активности бактерий? Методы изучения протеолитической и сахаролитической активности бактерий. Дифференциально-диагностические среды: перечислите, назовите основные составные части и применение. На какое изменение среды реагирует индикатор в этих средах? По какому признаку дифференцируются бактерии на средах Эндо, Левина, Плоскирева? Каким свойством должны обладать бактерии, чтобы образовать на этих средах окрашенные колонии? Если бактерии образуют бесцветные колонии, что это значит? Среды Гисса, их состав и применение. Что такое «пёстрый» или «цветной» ряд? Среда Олькеницкого, как производится посев и как отмечают на этой среде ферментативные свойства бактерий? Методы определения протеолитической активности бактерий: разжижение желатина, образование индола, сероводорода, аммиака. Что представляют собой микротестсистемы для определения ферментативной активности бактерий: как производят посев и как учитывают результаты? Что такое СИБ, как используется эта система, как производится посев и учёт результатов?Микрофлора воздуха: какие микробы чаще всего встречаются, как меняется микрофлора в зависимости от условий. Что такое микробное число воздуха, какими методами оно определяется? Что такое санитарно-показательные микроорганизмы? Какие микробы считаются санитарно-показательными для воздуха? Какие патогенные микробы могут передаваться через воздух?Определите понятия: нормальная микрофлора организма человека; постоянная микрофлора; транзиторные микроорганизмы; потенциально опасные микроорганизмы. Назовите органы и ткани, свободные от постоянной микрофлоры. Какие микробы относятся к постоянной микрофлоре полости рта и какое значение имеют в норме и патологии? Характеристика микрофлоры различных областей организма: полости рта, желудочно-кишечного тракта, органов дыхания. Значение нормальной микрофлоры - положительное и отрицательное. Что такое дисбактериоз, в чём он выражается, причины его возникновения и способы предупреждения и устранения. Назовите препараты, применяемые для устранения дисбактериоза, что они содержат, как применяются, что с ними происходит в организме человека.

Принципы, которыми руководствуются при санитарно-микробиологических исследованиях, исходят из основной задачи, разрешаемой ими: определение возможности присутствия в исследуемом объекте патогенных микроорганизмов или токсинов, образующихся в результате жизнедеятельности; обнаружение и оценка степени порчи изучаемого объекта (особенно пищевых продуктов).

Второй принцип - проведение серийных анализов. Серию проб берут из разных участков исследуемого объекта, что позволит получить более достоверную характеристику объекта. Доставленные в лабораторию пробы смешивают, затем точно отмеряют необходимое количество материала - среднее по отношению к исследуемому материалу в целом.

Третий принцип - повторное взятие проб (получение сопоставимых результатов).

Четвертый принцип - применение стандартных и унифицированных методов исследования, утвержденных соответствующими ГОСТами и инструкциями. Это позволяет в различных лабораториях получать сравнимые результаты.

Пятый принцип - одновременное использование комплекса тестов при оценке исследуемых объектов для получения разносторонней санитарно-микробиологической характеристики.

Шестой принцип - проведении оценки исследуемых объектов по совокупности полученных результатов, полученных при использовании санитарно-микробиологических тестов с учетом других гигиенических показателей, указанных в соответствующих ГОСТах и нормативах (органолептических, химических, физических и т. д.).

Седьмой принцип - ответственность сотрудников санитарной службы за точность обоснования выводов и заключений о состоянии исследуемых объектов.

Для большей объективности оценки получаемых результатов врачи пользуются специальными инструкциями, нормативами, ГОСТами, разработанными профильными санитарно-микробиологическими учреждениями и утвержденными Министерством здравоохранения и социального развития РФ. Эти стандарты периодически пересматриваются и приводятся в соответствие с изменениями, которые вытекают из практического опыта, материальных возможностей, современного уровня знаний и развития техники.

Методы санитарно-микробиологических исследований

Санитарная микробиология при индикации и идентификации санитарно-показательных, патогенных микроорганизмов, при определении общей микробной обсемененности объектов окружающей среды использует методы, которые применяются в диагностических микробиологических лабораториях:

- микроскопической (при индикации и прямом подсчете микроорганизмов в исследуемом объекте);
- бактериологический - выделение микроорганизмов и их идентификация;
- биологический - заражение чувствительных животных;
- ускоренные (инструментальные) методы (реакция иммунофлюоресценции, радиоизотопный метод и др.).

Комплекс тестов, используемых для разносторонней и полноценной санитарно-микробиологической характеристики объектов окружающей среды:

- определение количества аэробных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ);
- определение и титрование санитарно-показательных микроорганизмов;
- индикация в исследуемых объектах патогенных микроорганизмов и их токсинов;
- определение степени микробной порчи изучаемых объектов или продуктов.

Существует два метода определения КМАФАнМ:

- метод прямого подсчета (в счетных камерах Горяева или в камерах, для счета бактерий, на мембранных фильтрах, через которые пропускают исследуемую жидкость или взвесь);
- метод количественного посева различных разведений образцов и проб исследуемого объекта на плотные питательные.

Выявляются лишь мезофильные, аэробные или факультативно-анаэробные бактерии.

Оба метода являются относительными, приблизительными. Для получения сравнимых результатов определение общего микробного числа исследуемых объектов проводится по стандартным, конкретным для каждого случая методикам, регламентированным соответствующими ГОСТами.

Принципы, которыми руководствуются микробиологи при санитарно-микробиологических исследованиях, исходят из основной задачи, разрешаемой ими: определение возможности присутствия в исследуемом объекте патогенных микроорганизмов или токсинов, образующихся при их жизнедеятельности, а также обнаружение и оценка степени порчи пищевых продуктов.

Первым принципом является правильное взятие проб для санитарно-микробиологических исследований с соблюдением всех необходимых условий, регламентированных для каждого исследуемого объекта, и правил стерильности. Ошибки, допущенные при взятии проб, приводят к получению неправильных результатов, и исправить их уже нельзя. При упаковке и транспортировке проб необходимо создавать такие условия, чтобы не допустить гибели или размножения исходной микрофлоры в исследуемом объекте, что может исказить результаты исследований. Поэтому одним из правил является, возможно, быстрое проведение исследований, и, если необходимо, сохранение материала только в условиях холодильника и не более 6-8 часов. Каждая проба сопровождается документом, в котором указывают название исследуемого материала, номер пробы, время, место взятия, характеристика объекта, подпись лица, взявшего пробу.

Второй принцип – проведение серийных анализов исходит из особенностей исследуемых объектов. Как правило, вода, почва, воздух и другие объекты содержат разнообразные микроорганизмы, распределение которых неравномерно. К тому же микроорганизмы, находясь в биоценотических отношениях, подвергаются взаимному влиянию, что ведет к гибели одних и активному размножению других. Поэтому берут серию проб из разных участков исследуемого объекта, по возможности большее количество проб, что позволит получить более достоверную характеристику объекта. Доставленные в лабораторию пробы смешивают, затем точно отмеряют необходимое количество материала – среднее по отношению к исследуемому материалу в целом.

Третий принцип – повторное взятие проб – необходимо для получения сопоставимых результатов. Это связано, прежде всего, с тем, что исследуемые объекты весьма динамичны (вода, воздух и т.п.), сменяемость микрофлоры в них во времени и пространстве очень велика. Патогенные микроорганизмы попадают в окружающую среду, как правило, в небольшом количестве, да и распределяются в ней равномерно. Поэтому повторное взятие проб позволяет более точно определить биологическую контаминацию объектов окружающей среды.

Четвертый принцип – применение стандартных и унифицированных методов, утвержденных соответствующими ГОСТами и инструкциями, что дает возможность получить сравнимые результаты.

Пятый принцип – использование при оценке исследуемых объектов одновременно комплекса тестов для получения разносторонней санитарно-микробиологической характеристики. Применяют прямой метод обнаружения патогенных микроорганизмов и косвенный - позволяющий судить о загрязнении объектов окружающей среды выделениями человека и животных и его степени. К косвенным тестам относится определение общего микробного числа, количественного и качественного состава санитарно-показательных микроорганизмов. Применение косвенных методов оценки потенциальной возможности загрязнения объектов окружающей среды патогенными микроорганизмами, использование как бы обходного пути для изучения обсемененности материалов, является особенностью санитарно-микробиологических исследований.

Шестой принцип – заключается в проведении оценки исследуемых объектов по совокупности полученных результатов при использовании санитарно-микробиологических тестов других гигиенических показателей, указанных в соответствующих ГОСТах и нормативах (органолептических, химических, физических и т.д.). Всегда необходимо учитывать, что развитие микробов тесно связано с другими факторами окружающей среды, которые могут оказывать как благоприятное, так и неблагоприятное влияние, усиливая или ограничивая возможности размножения патогенных микроорганизмов и накопления их токсинов. Следует учитывать и то, что почти любой объект исследования имеет собственную микрофлору, которая вызывает специфические биохимические процессы, и те изменения в объектах, которые обусловливаются посторонними микроорганизмами. Санитарный микробиолог должен хорошо знать ход биохимических процессов, происходящих в норме и в исследуемом объекте (сырье, пищевые продукты, готовом изделии и т.д.), технологию производства, уметь определить характер вредного воздействия попавших микробов, возможные последствия такого воздействия и рекомендовать конкретные мероприятия по их предупреждению. Нередко врачу приходится прибегать к помощи специалистов в области общей, сельскохозяйственной, промышленной, ветеринарной микробиологии и решать вопрос при непосредственном участии соответствующих специалистов.

Седьмой принцип – ответственность врачей санитарной службы за точность обоснования выводов и заключений о состоянии исследуемых объектов. При санитарно-микробиологическом исследовании выявляется степень порчи пищевых продуктов (или других объектов), пригодность их к употреблению, возможная опасность для здоровья населения. Если пищевые продукты возможно реализовать, врач должен дать обоснованную рекомендацию о наиболее рациональном способе их обработки и употреблении. Запрещается использовать пищевые продукты, воду водоемов и др. Закрытие предприятия из-за санитарного неблагополучия наносит определенный экономический ущерб. Ответственность за такое решение несет врач санитарной службы. Для большей объективности в оценке полученных результатов и заключениях врачи пользуются специальными инструкциями, нормативами, ГОСТами, разработанными профильными санитарно-микробиологическими учреждениями и утвержденными Министерством Здравоохранения. Эти стандарты периодически пересматриваются и приводятся в соответствие с изменениями, которые вытекают из практического опыта, материальных возможностей, современного уровня знаний и развития техники.

Санитарно-микробиологическое состояние почвы оценивается на основании сопоставления количества термофильных бактерий и бакте-
рий – показателей фекального загрязнения. Почвы с преобладанием санитарно-показательных бактерий расцениваются как санитарно-неблагополучные, загрязнённые фекалиями человека или животных. Присутствие в почве E. coli и Enterococcus faecalis указывает на свежее (до 2 недель), бактерий родов Citrobacter и Enterobacter – на несвежее (до 2 месяцев), а Clostridium perfringens – на давнее (более 2 месяцев) фекальное загрязнение. Более точная оценка проводится с помощью определения коли-индекса – количество бактерий группы кишечной палочки (БГКП), обнаруженных в 1 г почвы, перфрингенс-титра – масса почвы (в граммах), в которой обнаружена 1 особь Clostridium perfringens, общего числа сапрофитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1 г почвы.

Микробиологические нормативы для оценки санитарного состояния почвы:

– чистая почва: коли-титр – 1 и выше; перфрингенс-титр – 0,01 и выше; ОМЧ – 100-1000;

– загрязнённая почва: коли-титр – 0,9-0,01; перфрингенс-титр – 0,009-0,0001; ОМЧ – 1000-100000;

– сильно загрязнённая почва: коли-титр – 0,009 и ниже; перфрингенс-титр – 0,00009 и ниже; ОМЧ – 10000-4000000.

Для определения ОМЧ почву берут на глубине 10-15 см стерильным ножом (из разных мест не менее 10 проб) в стерильную банку. Из проб готовят навеску 30 г, которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Готовят разведения 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 . Из 2-х последних разведений 0,1 мл смешивают с 40 мл 0,7% расплавленного и остуженного до 45 0 С МПА, после чего выливают двойным слоем в чашки с 2% агаром. Инкубируют в термостате. Подсчитывают количество выросших колоний.

Для определения коли-титра, перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии засевают по 1 мл в пробирки со средой Кесслера. Инкубируют при 43 0 С 48 часов. При получении в средах газообразования и помутнения производят высев петлей на среду Эндо. Отбирают типичные для кишечной палочки колонии, делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют. При выявлении в мазках грамотрицательных палочек ставят пробу на оксидазу. Если проба отрицательная, проверяют ферментативные свойства выделенной культуры посевом на полужидкую среду с глюкозой. Появление в среде кислоты и газа подтверждает наличие E. coli. Определяют коли-титр по наименьшему объёму, в котором обнаруживают БГКП.

Для определения перфрингенс-титра различные разведения почвенной суспензии засевают в пробирки со стерильной железосульфитной средой Вильсон-Блера. После 48 часов инкубации при 43 0 С учитывают результаты по образованию черных колоний C. perfringens в агаровом столбике среды. Мазки окрашивают по Граму, микроскопируют (крупные грамположительные палочки со спорами овальной формы, центрального или субтерминального расположения), вычисляют перфрингенс-титр (наибольшее разведение посевного материала, посев которого приводит к почернению и разрыву среды в первые 12 часов роста при 43 0 С).